用于培养基生长率评价的大肠杆菌标准物质研制（一） 质控菌株经过复苏和培养后

为满足快速高效评价微生物培养基生长率的用于需求，提出一种新的培养评微生物标准物质研制思路，并研制出具有2种特性量值的基生菌标大肠杆菌标准物质。研制过程中同时使用平板计数琼脂（plate count agar,长率肠杆PCA）培养基和结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile agar,VRBA）培养基进行均匀性评估、稳定性评估、准物质研制6家实验室合作定值以及不确定度评定。用于实验结果表明：大肠杆菌标准物质的培养评均匀性和稳定性良好，可以在–20℃下稳定保存6个月。基生菌标该标准物质基于PCA培养基的长率肠杆标准值为(7.1±1.1)×103 CFU/g，基于VRBA培养基的准物质研制标准值为(6.1±1.0)×103 CFU/g。使用该标准物质对多个PCA培养基和VRBA培养基的用于生长率进行评价，评价结果和国标方法有很好的培养评相关性。综上所述，基生菌标研制的长率肠杆大肠杆菌标准物质可以用于多种培养基的生长率评价，具有方便快捷的准物质研制优点。

0 引言

食品微生物检验是构建我国食品安全和生物安全体系的重要支撑和保障。而菌落总数和大肠菌群指标是食品微生物检验中最基本、最常见的检测项目。国家标准规定菌落总数和大肠菌群的检测分别需要平板计数琼脂（plate count agar,PCA）培养基和结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile agar,VRBA）培养基，因此这两种培养基的质量直接影响菌落总数和大肠菌群检测结果的准确性。PCA培养基和VRBA培养基的质量控制也受到了微生物研究机构、检测机构、生产厂家的高度重视。

生长率是培养基质量控制的关键指标之一。现行的生长率评价方法来自国标GB 4789.28—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》。该标准规定，PCA培养基和VRBA培养基的生长率评价都需要使用大肠杆菌作为质控菌株。质控菌株经过复苏和培养后，分别接种到待测培养基和参比培养基进行培养计数，且每个平板的接种水平需要控制在20～200 CFU之间。该方法费事费力，重复性和再现性有待提高。针对现行评价方法的缺陷，本项目组在之前的研究中提出一种基于微生物标准物质的生长率评价方法，即用于接种的质控菌株以标准物质的形式存在。该方法可以显著减少工作量、有效提高接种数量的准确性，并将时间缩短至1天以内。鉴于此，为了快速高效评价PCA培养基和VRBA培养基的生长率，需要研制量值精确、均匀稳定的大肠杆菌标准物质。

微生物计数结果具有较高的培养基依赖性。以大肠杆菌为例，同一大肠杆菌样本在不同种类培养基上可能得到差异显著的计数结果。目前我国仅有的3个有证大肠杆菌标准物质GBW(E)091094、GBW(E)091095、GBW(E)091096都是基于单种培养基进行定值和使用的。这3个标准物质难以满足PCA培养基和VRBA培养基生长率评价的需要。

综上所述，本文选用大肠杆菌标准菌株作为评价菌株，将其制备成标准物质。同时使用PCA培养基和VRBA培养基进行多家实验室合作定值，并对其均匀性、稳定性和不确定度进行评估或评定。研制的大肠杆菌标准物质将具有两种特性量值，可以用于PCA培养基和VRBA培养基生长率的评价。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

大肠杆菌：菌株号ATCC 25922，中国工业微生物菌种保藏中心。

1.1.2 主要培养基

PCA培养基：品牌分别为北京陆桥、广东环凯、青岛海博、美国BD、英国Oxoid，随机编号为A1、A2、A3、A4、A5。

VRBA培养基：品牌分别为北京陆桥、广东环凯、青岛海博、美国BD、英国Oxoid，随机编号为B1、B2、B3、B4、B5。

1.1.3 仪器

冻干机：Genesis SQ e L-85型，美国SP Scientific公司；电子天平：BS224S型，德国赛多利斯公司；离心机：1-14型，德国赛多利斯公司；恒温振荡培养箱：HZQ-X100型，江苏太仓市实验设备厂；恒温培养箱：DNP-9272型，上海精宏实验设备有限公司；去离子水机：Mill Q型，德国默克公司；高压灭菌锅：HG-50型，日本Hirayama公司。

1.1.4 试剂

磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution,PBS,p H 7.2±0.2）、营养肉汤培养基、胰蛋白胨大豆琼脂（tryptose soya agar,TSA）培养基：北京陆桥技术有限责任公司；脱脂奶粉：美国BD公司；海藻糖、蔗糖、谷氨酸钠、麦芽糊、抗坏血酸钠：分析纯，Sigma公司；西林瓶：规格为8 m L，深圳市宝安区沙井博海玻璃制品厂。

1.2 大肠杆菌标准物质的制备与测定方法

根据本实验室先前的制备工艺制备大肠杆菌标准物质。将大肠杆菌标准菌株接种于营养肉汤培养基，37℃、200 r/min培养12 h。随后10 000g离心5 min，弃去上清液，菌泥用PBS重悬并稀释，得到适宜浓度的大肠杆菌菌液。参考先前的配方配制保护剂，加入大肠杆菌菌液后，将保护剂分装至棕色西林瓶中。分装完毕，将西林瓶转移至冻干机内进行冻干。冻干结束将样品压盖密封，得到大肠杆菌标准物质200个单元，规格为0.5 g/瓶。

使用PCA培养基或VRBA培养基测定标准物质的方法参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》或GB4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》第二法。使用天平称量4.5 g无菌蒸馏水复溶标准物质，然后用PBS对样品匀液进行10倍系列稀释。选择3个适宜稀释度，每个稀释度分别吸取1 m L样品悬液接种于无菌平皿，每个稀释度至少重复3次。接下来使用PCA倾注平板法或VRBA倾注平板法进行大肠杆菌数量的测定。

1.3标准物质均匀性评估

根据JJF 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》的要求，按照随机抽样原则对标准物质的均匀性进行评估。随机抽取11个单元的标准物质，分别使用PCA倾注平板法和VRBA倾注平板法对每个单元标准物质的大肠杆菌数量进行测定，每瓶样品重复检测3次。

1.4 标准物质稳定性评估

稳定性考察主要涉及标准物质在运输过程中的稳定性、客户端的贮存条件和使用有效期。首先，对标准物质的短期稳定性进行评估。检验温度分别为–20℃和4℃，考察时间为7 d（分别为第0,1,3,5,7 d）。每次从–20℃和4℃下分别抽取3个单元的标准物质，使用PCA培养基和VRBA培养基进行大肠杆菌数量测定。接下来，按照先密后疏的原则，对标准物质的长期稳定性进行评估。长期稳定性检验温度为–20℃，考察时间为6个月（分别为第0,1,2,4,6个月）。每次从–20℃抽取3个单元，使用PCA培养基和VRBA培养基进行测定。

1.5 标准物质的定值

依据JJF 1343—2012和CNAS-GL29—2010的要求，标准物质经由6家通过CNAS认可的实验室合作定值。每家实验室分别使用PCA培养基和VRBA培养基测定3个单元的标准物质，每个标准物质重复测量3次，测量方法参考1.2节。大肠杆菌标准物质的标准值为6家实验室测量结果的平均值。

1.6 评价PCA培养基和VRBA培养基的生长率的方法

使用PCA（或VRBA）培养基，对一个单元的大肠杆菌标准物质进行3次重复测量，并根据下式计算大肠杆菌在该培养基上的生长率：

式中：PR——待测PCA（或VRBA）培养基的生长率；

NS-3次使用PCA（或VRBA）培养基测定标准物质的平均结果；

N0——大肠杆菌标准物质基于PCA（或VRBA)培养基的标准值。

大肠杆菌标准物质基于PCA培养基的标准值为(7.1±1.1)×103 CFU/g，基于VRBA培养基的标准值为(6.1±1.0)×103 CFU/g（见2.4定值结果的不确定度评定）。因此使用PCA培养基测定大肠杆菌标准物质的结果NS应大于6.0×103 CFU/g，使用VRBA培养基的测定结果NS应大于5.1×103 CFU/g。即待测PCA培养基的生长率应满足PR≥0.84的要求；待测VRBA培养基的生长率应满足PR≥0.83的要求。

1.7 不同品牌培养基生长率的评价

根据GB 4789.28—2013[9]的规定，PCA培养基和VRBA培养基的参比培养基均为TSA培养基。使用不同品牌的PCA培养基（A1～A5）和VRBA培养基（B1～B5）、以及参比培养基TSA，分别对3个单元的大肠杆菌标准物质进行测定。根据式（1）计算待测PCA培养基和VRBA培养基的生长率。同时参考国标方法，计算培养基的生长率，待测培养基的生长率为该培养基的测定结果与TSA的测定结果的比值。

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